一、实验目的
1．了解纸色谱的基本原理；
2、掌握用纸色谱分离氨基酸的一般操作。
二、基本原理
纸色谱是一种以滤纸为支持物的色谱方法，常用于多官能团或极性较大的化合物，如糖类、酯类、生物碱、氨基酸的分离等的分离。它因为设备简单、试剂用量少、便于保存，而为实验室常用方法。具有微量、快速、高效和灵敏度高等特点。
纸色谱的原理比较复杂，涉及分配、吸附和离子交换等机理，但分配机理起主要作用，因此，一般认为纸色谱属于分配色谱。
纸色谱以滤纸作载体。滤纸是由纤维素组成，纤维素上有多个—OH，能吸附水（在水蒸汽饱和的空气中，一般纤维能吸附20%～25%水份，其中约有67 %的吸附水是通过氢键与纤维素的羟基结合的，吸附极为牢固，一般条件下，很难脱去），这些吸附水就构成了色谱过程的固定相，展开剂(与水不相混溶的有机溶剂)为流动相，滤纸只起到支持固定相的作用。当样品点在滤纸一端，放在一密闭器中，让流动相通过毛细管作用从滤纸一端，经过点样点流向另一端，样品中溶质在固定相水、流动相有机溶剂中进行分配，因样品中不同溶质在两相中分配系数不同，易溶于有机溶剂而难溶于水的组份，随流动相往前移动速度快些，而易溶于水，难溶于有机溶剂的组份，随流动相向前移动速度慢些，从而达到将不同组份分离的目的。也可用测定Rf值方法对不同组分进行鉴定。
纸色谱的操作方分为滤纸和展开剂的选择、点样、展开、显色和结果处理（测量Rf值）五个部分。
1、滤纸的选择与处理
对普通实验来说，一般实验室中的滤纸都可以用。但在作某些定量测定或某些深入研究的工作中，对滤纸就要作适当的选择了。
（1）滤纸要求质地均匀、平整、边沿整齐、无折痕、有一定机械强度；
（2）滤纸纸质要求纯度高、无杂质，无明显萤光斑点，以免与色谱斑点相混淆；
（3）滤纸纤维松紧要适宜，过紧则展开太慢，过松则斑点扩散。
实验室用的滤纸可适用于一般的纸色谱分析。严格的研究工作中则需慎重选择层析用纸，并进行净化处理。例如分离酸性、碱性物质时，为保持恒定的酸碱度，可将滤纸浸泡在一定pH值的缓冲液中，进行预处理后再用。
将滤纸裁剪成条形时，应顺着纤维排列的方向。在裁剪滤纸时，要把周边裁剪整齐，不能留毛边。还要注意防止手垢和汗渍等杂质污染滤纸。
2、展开剂的选择
纸色谱用的溶剂一般要求:
(1) 纯度高。有时仅含1 %的杂质，也会相当大地改变被分离物质的Rf值。即便有微量的杂质存在，在溶剂移动和挥发过程中，也会形成杂质的浓集区域而影响检出。
(2)有一定的化学稳定性。若在展开过程中容易被氧化的溶剂不宜作为展开剂。
(3)容易从滤纸上除去。
纸色谱中，很少用单一溶剂作为展开剂，多用极性的混合溶剂，且其中之一是水。在选择展开剂时，一般按相似相溶原理进行。如果被分离物质是易溶于水，但难溶于乙醇的的强亲水性的，如氨基酸、糖类等，可选用含水量在 10～40 %之间的高含水量系统作为展开剂。若物质是可溶于乙醇和水，且较易溶于乙醇的中等亲水性的，则宜采用中等含水量的溶剂系统作展开剂。对于难溶于水，但易溶于亲脂性溶剂的物质，则展开剂主要组分是苯、环己烷、四氯化碳、甲苯等。对于完全亲脂性物质如甾醇等，最好采用反相系统，即用甲酚胺、二甲基甲酰胺等浸渍滤纸作固定相，可用含水的醇或与此相近的溶剂作为流动相。
溶剂系统的组成与含水量的变化规律是: 有机溶剂的极性越大，所配成的混合溶剂的有机相中含水量越高，反之，含水量越低。在有机溶剂的同系物中，分子量越大，所配成的混合溶剂有机相中水分含量越低。据此，可以根据需要选择合适的有机溶剂，配制一定含水量的溶剂系统，以获得较理想的Rf值。
对于酸性或碱性物质来说，由于其电离平衡现象的存在，展开时必将产生拖尾现象。因此，通常在溶剂中加入较强的酸 (如甲酸)或碱 (如氨)来抑制弱酸或弱碱的电离。另一种常用方法就是在滤纸上喷上缓冲盐类，以保持一定的pH值，干后再展开。但必须注意，展开剂也必须事先用缓冲液平衡后再使用。
溶剂的一般配制方法是将溶剂各组分按配方比例充分混合即可。如果混合液分层，则必须在充分振荡混合、静置分层之后，分出有机相作为展开剂。
3、样品处理
用于色谱分析的样品，要求初步提纯，如氨基酸的测定，不能含大量盐类、蛋白质，否则互相干扰，分离不清。固体样品应尽可能避免用水作溶剂，因水作溶剂斑点易扩散。一般选用乙醇、丙酮、氯仿等作溶剂。最好是选用与展开剂极性相近的溶剂。
4、点样
用内径约0.5mm的毛细管，或微量注射器吸取试样溶液，轻轻接触滤纸，控制样点直径在2~3mm，如样点直径过大，则会分离不清或出现拖尾。液体样品，可直接点样，不用配成溶液。
5、展开
纸色谱必需在密闭的层层析缸中展开。在层析缸中加入适量的展开剂，将点好样的滤纸放入缸中。展开剂水平面应在点样纸以下，绝不允许浸泡样品线。
按展开方法，纸色谱分为上行法（图1）、下行法（2）、水平法（图3）。
1、顶盖磨砂玻璃（必要时接缝涂凡士林）
2、滤纸条
3、展开剂
当展开剂移动到离纸边沿约1~2cm时，取出滤纸，用铅笔小心划出溶剂前沿，然后冷风吹干。如有色样品斑点可直接观察，并用铅笔划出斑点范围；呈萤光的样品，则在紫外灯光下观察斑点并用铅笔划出斑点范围；无色也无萤光性质的样品，则往往加入显色剂使之显色，再用铅笔划出斑点范围。
常见的纸色谱斑点拖尾现象有以下几种情况:
①点样量过多，样品量超过了点样处滤纸所荷载的溶剂能够溶解的能力。
②某些物质可以形成多个电离形式，且各自有其不同的Rf值，因而在纸上造成连续拖曳，这种情况可使用碱性或酸性的展开系统，抑制其电离即可消除。
③被分离的物质与滤纸上的Cu2+、Ca2+、Mg2+等杂质形成络合物而形成拖尾，可改用纯滤纸展开。
④某些物质在展开过程中会逐渐分解，如肾上腺素和某些含硫氨基酸等，可将它们转变成稳定的物质再作展开来克服。
⑤当被分离的物质能溶于显色剂中时，如显色剂用量过多，可使斑点模糊或拖长。
三、主要仪器与药品
仪器：条形滤纸（5cm×15cm）、色谱缸、内径0.3 mm毛细管(微量注射器)、干燥箱、喷雾器、电吹风、剪刀、直尺、铅笔
药品：标准液（1%亮氨酸/乙醇溶液、1%赖氨酸/乙醇溶液），样品混合液（含亮氨酸、赖氨酸的乙醇溶液），0.5%茚三酮乙醇溶液，展开剂（正丁醇∶冰乙酸∶水=4∶1∶5，在分液漏斗中充分混合，静止分层，取上层作展开剂）
四、实验步骤
1、准备滤纸
取一张条形滤纸（5cm×15cm），平放在一张洁净纸上，用铅笔在滤纸一端距底边 15～20 mm处轻划一平行线，在线上标出三个点，各点间距离约为8～12 mm，并用铅笔标明各点对应 “亮”、“赖”、“混”字。
2、点样
用毛细管吸取样品溶液少许对应点进行点样，样点直径为2~3 mm，最好将混合样点在中间点的位置。注意同一毛细管只能用于一种物质的点样。点好样品，风干或吹风机吹干。
3、饱和与展开
将一点好样品的滤纸悬吊于装有展开剂的色谱缸中，用盖盖好。注意不可使滤纸与溶剂接触。静置20～30 min(一般为1～2 h)让溶剂蒸汽对滤纸进行饱和。
点样端向下，将饱和后的滤纸的点样点以下垂直浸入展开剂中，盖好，展开约 l h。溶剂的前沿升到接近滤纸顶端时，取出滤纸，立即用铅笔画出溶剂前沿所在位置，吹干。
4、显色
用喷壶距滤纸约30～40 cm向滤纸均匀喷洒显色剂，以滤纸基本打湿为宜。然后用吹风机热风缓缓吹干并加热滤纸，直到显示出紫色斑点为止。
5、测量Rf值与鉴定
用铅笔将所有斑点的轮廓描出来，并确定出各斑点的重心位置，该点即为斑点位置。分别量出点样点到溶剂前沿的距离和各斑点位置的距离，按照Rf值定义计算各斑点的Rf值。比较各斑点的Rf值大小，确定混合样点上的两个斑点各是什么物质。
五、注意事项
1. 注意同一毛细管只能用于一种物质的点样；注意点样的次序不要混淆；
2. 样点不能过大；点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴，为使样品加速干燥，可用电吹风加热干燥，但要注意温度不可过高，以免破坏氨基酸，影响定量结果；
3.展开剂液面不能高于起始线；即溶剂展层至距离纸的上沿约1cm时，注意不能使溶剂走过头。
六、思考题
1. 为什么纸色谱点样点的直径不得超过5 mm? 斑点过大或样品量过大有什么弊病? 为什么?
2. 手拿滤纸时，应注意什么？为什么？色谱缸为什么要密闭?
3. 上行展开时，样品点为什么必须在展开剂的液面之上？
4. 作原点标记能否用钢笔或圆珠笔？为什么？
5. 点样品时所用毛细管为什么要专管专用？
